היתרונות של שימוש באנזימים סוף דביקים

תוֹכֶן

• אנזימים והגבלות אתרי הגבלה
• האוריינטציה הנכונה
• שכיבה של קצוות דביקים דורשת פחות DNA
• אנזימים שונים יכולים לתת את אותו סוף דביק

שיבוט מולקולרי הוא שיטה ביוטכנולוגית נפוצה שכל סטודנט וחוקר צריכים להכיר. שיבוט מולקולרי תוך שימוש בסוג אנזים הנקרא אנזים הגבלה לחתוך DNA אנושי לשברים שניתן לאחר מכן להכניס ל DNA ה- פלסמיד של תא חיידקי. אנזימי הגבלה חותכים את ה- DNA עם כפול גדילים לחצי. בהתאם לאנזים המגביל, החיתוך יכול לגרום לקצה דביק או לקצה קהה. קצוות דביקים שימושיים יותר בשיבוט מולקולרי מכיוון שהם מבטיחים כי שבר ה- DNA האנושי יוחדר לפלסמיד בכיוון הנכון. תהליך הקשר, או מיזוג של שברי DNA, דורש פחות DNA כאשר ל- DNA יש קצוות דביקים. לבסוף, אנזימים רבים של הגבלת קצה דביקים יכולים לייצר את אותו קצה דביק, למרות שכל אנזים מזהה רצף הגבלה שונה. זה מגדיל את הסיכוי שאזור האנזים ה- DNA שלך יכול להתנתק על ידי אנזימי קצה דביקים.

אנזימים והגבלות אתרי הגבלה

אנזימי הגבלה הם אנזימים שחותכים מזהים רצפים ספציפיים ב- DNA עם גדיל כפול וחותכים את ה- DNA לשניים ברצף זה. הרצף המוכר נקרא אתר ההגבלה. אנזימי הגבלה נקראים אנדונוקליזות מכיוון שהם חותכים DNA-גדילי כפול, וכך בדרך כלל קיים DNA, במיקומים שנמצאים בין קצות ה- DNA. ישנם יותר מ 90 אנזימי הגבלה שונים. כל אחד מזהה אתר הגבלה מובהק. אנזימי הגבלה חוסמים את אתרי ההגבלה שלהם בהתאמה פי 5,000 יותר מאשר אתרים אחרים שאינם מכירים.

האוריינטציה הנכונה

אנזימי הגבלה מגיעים בשני שיעורים כלליים. הם חותכים DNA לקצוות דביקים או לקצוות בוטים. בקצה הדביק יש אזור קצר של נוקליאוטידים, אבני הבניין של ה- DNA, שאינם מותאמים. אזור לא מזווג זה נקרא תליה. אומרים שההתלה היא דביקה מכיוון שהיא רוצה וישתלב עם קצה דביק נוסף שיש לו רצף תלייה משלים. קצוות דביקים הם כמו תאומים שאבדו מזמן המבקשים לחבק אחד את השני בחוזקה ברגע שהם נפגשים. מצד שני, קצוות בוטים אינם דביקים מכיוון שכל הנוקלאוטידים כבר מזווגים בין שני גדילי ה- DNA. היתרון של קצוות דביקים הוא שקטע של DNA אנושי יכול להשתלב רק בפלסמיד חיידקי בכיוון אחד. לעומת זאת, אם לדנ"א האנושי וגם לפלסמיד החיידקי יש קצוות בוטים, ניתן להכניס את הדנ"א האנושי ראש לזנב או זנב לראש לפלסמיד.

שכיבה של קצוות דביקים דורשת פחות DNA

אף על פי ש- DNA עם קצוות מקל יש זמן קל יותר למצוא זה את זה בגלל ה"דביקות "שלהם, לא קצוות דביקים או קצוות בוטים לא יכולים להתמזג יחדיו לרסיסה של DNA. היצירה של פיסת DNA רציפה המקושרת לחלוטין דורשת אנזים הנקרא ליגאז. ליגזים מחברים את עצמות הגב של נוקלאוטידים בקצוות הדביקים או הבוטים, וכתוצאה מכך לשרשרת רציפה של נוקליאוטידים. מכיוון שהקצוות הדביקים מוצאים אחד את השני מהר יותר בגלל המשיכה שלהם זה לזה, תהליך הקישור דורש פחות DNA אנושי ופחות DNA מהפלסמיד. הקצוות הבוטים של ה- DNA והפלסמידים פחות ימצאו זה את זה, ולכן קשירת הקצוות הבוטים מחייבת להכניס יותר DNA לצינור המבחן.

אנזימים שונים יכולים לתת את אותו סוף דביק

אתרי הגבלה ממוקמים בכל הגנום של האורגניזמים, אך אינם מרוחקים באופן שווה. בפלסמידים ניתן להנדס אותם למקם ממש אחד ליד השני. מדענים שרוצים לחתוך קטע של DNA אנושי מהגנום האנושי צריכים למצוא אתרי הגבלה שנמצאים בחזית ומאחורי אזור השבר. בנוסף להבטיח כי מוחדר שבר DNA בכיוון הנכון, אנזימי קצה דביקים שונים יכולים ליצור את אותו קצה דביק למרות שהם מזהים רצפי הגבלה שונים. לדוגמה, ל- BamHI, BglII ו- Sau3A יש רצפי זיהוי שונים אך מייצרים את אותו קצה דביק של GATC. זה מגדיל את הסיכוי שיהיו אתרים להגבלת קצה דביקים המאגפים את הגן האנושי שלך שמעניין אותו.