תוֹכֶן
בתגובות כימיות המנותזות על ידי אנזים, האנזים מוריד את כמות אנרגיית ההפעלה הנדרשת על ידי קשר זמני עם המצע וסיבובו למצב מתוח. ה- k (זרז) או "kcat" לתגובה מתייחס לקבוע שאינו תלוי בריכוז עבור הקצב בו אנזים מסוים יכול לחילוף חומרים של מצע למולקולת מוצר. כדי לחשב kcat, מדענים מערבבים תחילה כמה מבחנות עם ריכוזים שונים של מצע (המכונה "assay אנזימטי") ובודקים אותם במרווחי זמן קבועים בעזרת ספקטרופוטומטר קל למדידת הריכוזים הגוברים של מולקולות מוצר. לאחר מכן נתון זה מתווה על גבי גרף ומנותח.
חישוב מהירויות ראשוניות
צרו תרשים של ריכוז המוצר לעומת זמן לנתונים ממבחנה האנזימטי הראשון. הערה: הציר האופקי צריך להיות "זמן", והציר האנכי צריך להיות "ריכוז מוצר."
חשב את קו הרגרסיה הליניארית עבור נקודות הנתונים שתכננת בסעיף 1, שלב 1. בעוד מחשבונים של Excel וגרפים יכולים לקבוע בקלות מודל לינארי זה, אתה יכול לגזור הערכה של שיפוע קווי הרגרסיה על ידי חלוקת ההבדל בריכוז המוצר בין נתונים סמוכים נקודות לפי הפרש הזמן שלהם.
רשמו את שיפוע קו הרגרסיה הליניארית מקטע 1, שלב 2 כ"מהירות התגובה הראשונית (Vo). " הערה: במודל קו הרגרסיה "= m + b," המקדם "m" הוא המדרון.
חזור על שלבים 1, 2 ו -3 עבור שאר צינורות המבחן במבחן.
חישוב Vmax
משרטט את ההיפוך של ריכוז המצע לכל צינור מבחן לעומת ההיפוך של מהירות התגובה הראשונית שלו (מסעיף 1, שלב 4). לדוגמה, אם המהירות ההתחלתית של צינור מבחן עם ריכוז מצע ראשוני של 50 מיקרומולר (uM) הייתה 80 אמ"ש / ים, ההיפוכים היו 1/50 אמ"ם לריכוז המצע ו 1/80 אמ"ש לשעה הראשונית מהירות. הערה: ריכוז המצע ההפוך צריך להיות על הציר האופקי, והמהירות ההתחלתית ההפוכה צריכה להיות על הציר האנכי.
הערה: ריכוז המצע צריך להיות על הציר האופקי, ומהירות התגובה הראשונית צריכה להיות על הציר האנכי.
קבע את קו הרגרסיה הליניארית עבור התרשים שתיכננת בסעיף 2, שלב 1. שים לב: מכיוון שתצטרך לדעת את צומת ה- y עבור קו הרגרסיה, עליך להזין את הנקודות מסעיף 2, שלב 1, ל- Excel או ל- גרף מחשבון והשתמש בפונקציונליות של דוגמנות רגרסיה מובנית.
חלק 1 על ידי צומת ה- y מקו הרגרסיה הליניארית. זה ייתן לך את הערך ההפוך של Vmax, מהירות התגובה המרבית לאנזים. הערה: אם מודל הרגרסיה הליניארית לובש את הצורה "= m + b", אז הערך של "b" יהיה צומת ה- y. חלק 1 על ידי "b" כדי לחשב את ההיפוך של Vmax.
חלק 1 לפי התוצאה מסעיף 2, שלב 3 לחישוב הערך בפועל של Vmax.
קבע את ריכוז האנזים במבחן המקורי (ראו את הנתונים הגולמיים). הערה: ריכוז האנזים זהה לכל צינורות המבחן; רק ריכוזי המצע משתנים בבדיקה.
חלקו את ה- Vmax (מסעיף 2, שלב 4) לפי ריכוז האנזים (מסעיף 2, שלב 5). התוצאה היא הערך של Kcat.