תוֹכֶן
כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) היא טכניקת מעבדה המשמשת להפרדה וזיהוי תרכובות. זהו סוג של כרומטוגרפיה של העמודים הנשען על קוטביות שונות של תרכובות בתמיסה על מנת להפריד ביניהן. HPLC שונה מכרומטוגרפיה של עמודות רגילות מכיוון שהיא משתמשת בלחץ בכדי להכריח את הפיתרון דרך העמוד במהירות רבה יותר, ולכן מייצרת תוצאות מהירות יותר, ולעיתים מדויקות יותר. המטרה היא להפריד תרכובות בעמודה ולגרום להן לצאת בנפרד.
Coelution
בגלל המהירות של HPLC והיא מסתמכת על קוטביות שונות של תרכובות, שני תרכובות עם מבנה וקוטביות דומות יכולות לצאת ממנגנון הכרומטוגרפיה באותו זמן או כמעט באותה העת. זה ידוע כ- coelution. Coelution מקשה על קביעת המדויק באיזה חלק מהתערובת התחמקה באיזו נקודה.
תרכובות סופגות
HPLC משתמש בדרך כלל בעמודת זכוכית מלאה בחרוזים העשויים מחומרים שונים. לתערובות הנאלצות דרך העמוד יש כימיקלים הנקשרים בעוצמות שונות לחרוזים. עוצמת הכריכה, התלויה בדמיון בקוטביות, קובעת כמה זמן הכימיקל ייקשר לחרוז לפני שהוא ישוחרר. חלק מהתרכובות נקשרות חזק כל כך, עד שלמעשה הן לעולם לא משתחררות מהחרוזים שבעמודה ואף פעם לא נמדדות בתמיסה היוצאת מהעמודה.
עלות
טכניקות הפרדת מעבדה אופייניות כוללות פיתוח assay, או שיטת הפרדה, ואז יישום assay להפרדת תרכובות בודדות מפיתרון. עם זאת זה בדרך כלל מביא לפתרונות מרובים שצריכים גם הם לעבור נהלים, מה שמוביל לעלייה מעריכית במורכבות. למרות שלעתים קרובות HPLC יכול לפשט ולזרז את התהליך הזה, עלות פיתוח מכשיר HPLC יכולה להיות אדירה. פיתוח מכשיר HPLC, אם כי יעיל בהרבה, הוא יקר בהרבה מאשר פיתוח מבחנים אחרים להפרדת תרכובות. זה הופך אותו לא בר-קיימא מבחינה כלכלית עבור הרבה מעבדות קטנות בבעלות פרטית.
מורכבות
HPLC אינו משמש רק להפרדת תרכובות פשוטות, הוא משמש גם לבידוד חלבונים ספציפיים מתערובת תאית. במקרה זה החרוזים בעמודה מצופים בדרך כלל בנוגדן ספציפי לחלבון שעליך לאסוף. החלבונים קושרים את הנוגדנים והתמיסה שנותרה מועברת דרך העמוד, ואז החלבונים משתחררים באמצעות תמיסה אחרת ונאספים. זה דורש טכנאי מיומן מאוד לפקח על העמודה בכל עת ולוודא שהתהליך פועל בדיוק כמתוכנן.