תוֹכֶן
כתם גרם הוא הליך מכתים דיפרנציאלי המראה אילו חיידקים הם חיובי גרם או שלילי גראם על סמך צבע הכתם שלהם. אלכוהול אצטון הוא מגיב אחד המשמש בתהליך זה כדי לספק את ההבדל בצבעים. לחיידקים חיוביים לגרם יש שכבה פפטידוגליקנית עבה וכתמים בצבע סגול, ואילו למיקרואורגניזמים שליליים גראם יש מעט עד ללא שכבה פפטידוגלנית וכתמים בצבע ורוד.
סגול סגול קריסטל כתם
לאחר הכנת שקופית של דגימה חיידקית, משמש סגול קריסטל כדי להכתים את הדגימה תחילה. בשלב זה גם חיידקים גראם-חיוביים וגם גרם-שליליים יופיעו סגולים. בדרך כלל סגול הקריסטל מוחל על השקופית למשך 30 שניות לפני שטיפת כתמים עודפים במים. סגול הקריסטל יכול להידבק מעט בשכבות הפפטידוגליקניות כך שלא כל הכתם הראשוני יישטף עם המים.
מורדנט-יוד
לאחר מכן מוסיפים יוד למדגם למשך דקה אחת. זה משמש כמורדנט המשמש לתיקון צבעים בתהליך מכתים. יוד מבצע פונקציה זו על ידי כריכה לסגול הקריסטל ויצירת קומפלקס בלתי מסיס שדבק הרבה יותר בשכבה הפפטידוגליקית העבה שנמצאת בתאי חיידקים גראם חיוביים מאשר רק בסגול הסגול בלבד. אין צעד של שטיפה עם מים לאחר הוספת היוד.
מרקם-אלכוהול
ניתן להשתמש באצטון או באתיל אלכוהול כחומר הסיסון. האלכוהול ממיס את השומנים שנמצאים בקרום התא החיצוני של חיידקים שליליים גרם, ומאפשר למתחם יוד סגול-קריסטל לדלוף אל מחוץ לשכבה הפפטידוגליקית הדקה יותר. האלכוהול מתווסף למשך 10 עד 20 שניות; הוא מוזג על השקופית עד שכל היוד נשטף וההמראה ללא צבע. בשלב זה בתהליך הכתם גראם, חיידקים גראם-שליליים הם חסרי צבע ואילו חיידקים גראם-חיוביים עדיין שומרים על סגול הגביש. לאחר סיום יש לשטוף את השקופית במים כדי להפסיק את אפקט הסיסמא.
הרוחב-ספרנין
לאחר מכן מתווספת ספרנין כדי להגדיל את הנראות והניגודיות לחיידקים חסרי-השליל ללא גרם. הכתם גורם לחיידקים אלה להיראות ורודים מתחת למיקרוסקופ. מכיוון שהכתם מתווסף לכל הדגימה, הוא מכתים גם חיידקים חיובי גראם, אך הכהה יותר בסגול הקריסטל מסתיר את הצבע הוורוד הספרניני הבהיר יותר. לאחר שדגימה של השקופית הוצפה בספרנין במשך כדקה, משתמשים במים בכדי לשטוף את כל הכתם העודף שלא דבק בתאי החיידק.